El primer vuelo del Ju 90 V-1 tuvo lugar el 28 de agosto de 1937. Sus impresionantes dimensiones pronto le valieron el sobrenombre en alemán de “Der grosse Dessauer” (en referencia a la ciudad alemana de Dessau en la que se fabricaba). La prueba de vuelo se desarrolló satisfactoriamente y la fabricación de otros tres modelos de pruebas avanzó rápidamente. La prueba de recorrido se realizó con la compañía aérea Deutsche Lufthansa. Tanto la prensa como los pasajeros se mostraron rápidamente entusiasmados con el nuevo avión comercial de gran capacidad de Junkers, en cuyo amplísimo fuselaje podían volar cómodamente hasta 40 viajeros. Esto no cambió ni siquiera con la caída de un aparato durante un vuelo de prueba el 7 de febrero de 1938 y la trágica pérdida del Ju 90 V-2 “Prusia” en un accidente durante el despegue el 26 de noviembre de 1938 en la ciudad africana de Bathurst. En total se había previsto la fabricación de diez prototipos, el cuarto de los cuales constituyó el punto de partida para el en realidad modelo de serie Ju 90 Z-2. La compañía Deutsche Lufthansa realizó un pedido de 12 de estos aparatos de los cuales únicamente pudieron entregarse seis hasta 1940. Todos ellos, así como los correspondientes prototipos, obtuvieron buenos resultados en los trayectos dentro de Alemania y dentro de Europa. Por ejemplo, solo el Ju 90 V-3 “Baviera” voló en 1938 con un total de 62.572 Km. el 0,4% de toda la capacidad de transporte de Deutsche Lufthansa. Sudáfrica encargó como primer y único cliente extranjero otros dos aviones que tendrían que haberse equipado con motores Pratt Whittney SC-G “Twin Wasp” de 883 kW de potencia cada uno. Sin embargo, estos aparatos denominados Ju 90 Z-3 nunca llegaron a ser entregados a la compañía aérea South African Airways y en su lugar se quedaron, equipados con motores BMW 132, en manos de las Fuerzas Aéreas alemanas de la época.
Algunos meses después del comienzo de la guerra, la compañía alemana Lufthansa tuvo que ceder la mayoría de sus Ju 90 a esas mismas fuerzas aéreas, donde fueron utilizados por lo general para tareas de transporte. Algunos de los aparatos fueron devueltos después a Lufthansa y se utilizaron en más o menos servicios de línea regulares, por ejemplo a España. Solo tres de estos aviones sobrevivieron a la guerra, pero poco después se desguazaron todos sin excepción.
